logo

Культивирование вирусов в культуре клеток

Вирус накапливается в основном в культуральной жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием — оттаиванием (2—3 раза), или с помощью ультразвука.

Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток.

Существуют следующие основные методы индикации вируса в культуре клеток: по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию (ЦПЭ,ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.

ЦПД.

Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток под влиянием размножающегося в культуре клеток вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8—10, окуляр х7—10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 — на 3 креста, если 1/2 – на 2 креста, 1/4 — на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.

Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2—3 сут после заражения (энтеровирусы), другие — через 1—2 нед (аденовирусы).

Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование (рис. 1,2)

Фрагментация — разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).

Округление — потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).

Симпластообразование — растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней, некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.). Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.

При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).

Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к "слепым" пассажам. Необходимо провести не менее трех "слепых" пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.

РГАд. Гемадсорбция — соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток — впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В последующем выяснилось, что этой способностью обладает ряд других вирусов: парагриппозные, оспо-вакцины и оспы, ньюкаслской болезни, гриппа млекопитающих и птиц. Наиболее ценным оказалось применение этой реакции для выявления и идентификации парагриппозных вирусов животных (ПГ-3 крупного рогатого скота, парагриппа овец, вируса Сендай). В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках. Для постановки реакции используют эритроциты морской свинки, обезьян, человека (группы О) и другие эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию изучаемого вируса.

Перейти на страницу:
1 2 3 4 5

 


Copyright © 2013 - SimpleBiology.ru - Все права защищены