logo

Культивирование вирусов в культуре клеток

Методика РГАд

Состоит в следующем. На 3—4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2—3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5—10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной

В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:

-эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде "ожерелья" (вирус африканской чумы свиней);

-эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);

-эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).

Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов. Если вирус на данной культуре клеток вызывает и ЦПД, и РГАд, то гемадсорбция проявляется раньше, чем ЦПД. Метод этот пригоден для индикации в культурах клеток только некоторых вирусов и поэтому применяется нечасто. Однако для индикации ряда вирусов (вирусы африканской чумы свиней, парагриппа-3 крупного рогатого скота и др.) он незаменим При отсутствии гемадсорбции на 3—4-й день после инфицирования через каждые 2—3 дня берут следующие пробирки с инфицированной культурой клеток и ставят РГАд по описанной выше методике. Пробирки с культурой клеток находятся под наблюдением в течение 14—20 дней. При отрицательной реакции гемадсорбции в первом пассаже проводят следующий пассаж и РГАд.

РГАд используют для обнаружения вируса в культуре клеток, для титрования его и при постановке реакции нейтрализации с целью определения титра антител в сыворотках крови животных.

Метод образования бляшек.

Этот метод обнаружения вирусов технически сложнее других и применяется главным образом для титрования вирусов.

Дальбекко и Фогт в 1954 г. впервые предложили методику получения бляшек под агаром в культуре куриных фибробластов с вирусом западного лошадиного энцефаломиелита. В последующие годы многие авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов — ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чистых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогтом, модифицировали, и в настоящее время есть целый ряд отличных друг от друга методов, связанных с изучением различных вирусов.

Метод бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель — нейтральрот, негативных колоний или бляшек. Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. Кроме агара в целях предотвращения переноса вируса на другие места можно использовать крахмал и метилцеллюлозу. Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др.

При постановке бляшек особое внимание должно быть обращено на качество культуры, она должна иметь сплошной рост клеток без признаков дегенерации. Лучше всего использовать культуры, выращенные во флаконах или матрасах различного типа. На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно установленный отрезок времени (1-2ч) при 37 -38 градусах Цельсия. Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хэнкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.

Обычные компоненты агарового покрытия — агар, раствор Эрла, телячья сыворотка, нейтральный красный, раствор соды (NaHC03), среда, антибиотики.

После застывания (30—60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом. Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней. За это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проникают в последние, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние клетки. В сплошном слое живых клеток возникают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток. Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мертвых клеток. Бляшки в культуре клеток образуют многие вирусы. При большой плотности (соответствующей низким разведениям вируса) они часто сливаются друг с другом. Время появления и морфология бляшек зависят от вида и штамма вируса, типа клеток и условий культивирования.

Перейти на страницу:
1 2 3 4 5

 


Copyright © 2013 - SimpleBiology.ru - Все права защищены