logo

Культивирование вирусов в культуре клеток

В основу титрования вирусов положены наблюдения Дальбекко и Фогта, показавших линейную зависимость между дозой внесенного вируса и количеством образующихся бляшек. Они показали, что для образования одной бляшки достаточно одной инфекционной вирусной частицы. Однако это положение верно при определенных условиях, и, прежде всего, при внесении в культуру больших разведений вирусов, исключающих возможность множественного заражения клеток.

Цветная проба.

Цветную пробу для лабораторных исследований впервые предложили Солк, Янгнер и Уорд в 1954 г. Предпосылкой для разработки данного метода явились наблюдения Эндерса, Уэллера и Роббинса, которые отметили, что в незаражен-ных тканевых культурах под влиянием продуктов метаболизма рН среды сдвигается вкислую сторону, что улавливается попожелтению фенолрота, добавленного в питательную среду. В то же время жидкость в тканевых культурах, зараженных вирусом, убивающим живые клетки, сохраняла свой красный цвет. Наиболее отчетливые результаты дают вирусы с высокой скоростью размножения при культивировании их на медленнорастущих клетках. Это способ не не отличается высокой достоверностью

Обнаружение внутриклеточных включений.

При многих вирусных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных органов и тканей появляются особые образования, называемые тельцами-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, составу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности.

Тельца-включения локализуются избирательно: при оспе, гриппе, бешенстве, парагриппе и других болезнях, как правило, развиваются цитоплазматические включения; при ринотрахеите крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других — ядерные.

Для приготовления препаратов культур клеток с целью выявления телец-включений клетки выращивают на покровных стеклах в пробирках или пенициллиновых флаконах, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации при 37 °С (что зависит от свойств инокулированного вируса) стекла вынимают, промывают в теплом растворе Хенкса или физиологическом растворе (рН 7,0—7,2), подсушивают фильтровальной бумагой и фиксируют в одной из фиксирующих смесей: растворе Буэна — 10—15 мин, фиксаторе Карнуа — 10, Ценкера—20—30, метиловом спирте —15 мин или в других фиксаторах. Затем препараты окрашивают.

Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5—15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.). Время окрашивания подбирают эмпирически для каждой культуры клеток и краски. Затем препараты отмывают водой и помещают на 1—2 мин в аммиачную воду (на 200 мл дистиллированной воды добавляют 2—3 капли аммиака). В щелочной среде ядра клеток приобретают синий цвет. Далее препараты окрашивают 0,1%-ным водным раствором эозина 30—60 с, удаляют лишнюю влагу фильтровальной бумагой, проводят по спиртам возрастающей концентрации: 70, 80, 96 (первый раз), 96 (второй раз), 100° + ксилол (1 : 1), ксилол и заключают в бальзам. В каждом из спиртов и ксилоле препараты держат не более 1 мин. Перед перенесением препаратов в следующую бюксу обязательно снимают с него фильтровальной бумагой лишнюю влагу, иначе спирт будет обводняться. При окраске гематоксилин-эозином ядра клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма — в розовый, а тельца-включения — в синий или розовый Для обнаружения телец-включений при гриппе довольно часто используют окраску культур клеток по методу Клисенко. Для этого стекла с зараженной культурой клеток споласкивают теплым (37 °С) физиологическим раствором и фиксируют в жидкости Дюбоска — Бразила—Буэна от 20 мин до нескольких недель. Тщательно отмытые (3—4 раза) в дистиллированной воде объекты окрашивают 10 мин 1%-ным раствором акридинового оранжевого, тщательно отмывают дистиллированной водой, затем снова окрашивают 1%-ным раствором эозина 30 мин, промывают дистиллированной водой и допропитывают раствором (1 : 1000) метиленового синего. Последний готовят перед употреблением из 1%-ного маточного раствора.

Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой, дифференцируют в подкисленном (2—3 капли ледяной уксусной кислоты на 50 мл спирта) абсолютном спирте до появления розово-синего оттенка. Обезвоживают абсолютным спиртом и, проводя через ксилол, заключают в бальзам. Цитоплазма окрашивается в нежно-розовый цвет, ядро — в розово-сиреневый, ядрышки — в синий, вирусные включения — в ярко-красный .

Для окраски клеток крови, костного мозга или культур клеток из лимфоидных органов обычно применяют окраску по методу Романовского—Гимзы.

Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции.

В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.

Перейти на страницу:
1 2 3 4 5

 


Copyright © 2013 - SimpleBiology.ru - Все права защищены